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Tierartenspezifischen Nachweis von Fleisch- und Knochenmehl in Futtermitteln mittels im Phage Display ermittelter Affinitätspeptide

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: BfR-LMS-08-1322-524
Laufzeit: 01.03.2012 - 31.12.2013
Forschungszweck: Experimentelle Forschung

Im Rahmen der BSE-Bekämpfung (Bovine Spongiforme Enzephalopathie) wurde die Verfütterung von Fleisch-und Knochenmehlen (FKM) an Nutztiere in Europa verboten (Verordnung (EG) Nr. 999/2001). Darüber hinaus wurde ein Inter-Spezies-Verfütterungsverbot festgelegt (Verordnung (EG) Nr. 1069/2009). Die einzige Ausnahme von dem strengen FKM-Verbot ist Fischmehl, das für die Verfütterung an Schweine und Geflügel erlaubt wurde und in Milchaustauschern für Kälber verwendet werden kann (Verordnung (EG) Nr. 999/2001). Das offizielle Verfahren für den Nachweis von Tiermehlen in Futtermitteln basiert auf der klassischen Lichtmikroskopie (Verordnung (EG) Nr. 152/2009). Die Mikroskopie ermöglicht jedoch nicht, zwischen verschiedenen Arten oder Gattungen zu unterscheiden. Alternative Nachweisverfahren, wie z.B. die Polymerasekettenreaktion (PCR), immunologische Verfahren (ELISA) oder Massenspektrometrie weisen hinsichtlich ihrer Spezifität, Selektivität oder Sensitivität verschiedene Defizite auf (Fumière et al. 2009). Das bestehende Inter-Spezies-Verfütterungsverbot kann daher nicht befriedigend überwacht werden. In der Konsequenz besteht weiterhin dringender Bedarf an der Erforschung, Entwicklung und Validierung alternativer Methoden, um die vorhandenen Lücken in der Überwachung zu schließen. Ziel des nachfolgend skizzierten Projektes ist die Entwicklung spezifischer, hoch-affiner an das Knochenprotein Osteocalcin bindender Peptide, welche in ähnlicher Weise eingesetzt werden können, wie traditionell in Tieren gewonnene Antikörper in immunologischen Verfahren (ELISA- oder Dipsticks). Zur Generierung von „Affinitätspeptiden“ wird die Technik des Phage Display genutzt, bei welcher in einem in-vitro Prozess an das nachzuweisende Zielprotein bindende Peptide selektiert und angereichert werden. Auf diese Weise soll schließlich mit Hilfe eines Affinitätspeptid-Paares ein von Antikörperchargen und kommerziellen Anbietern vollkommen unabhängiges und reproduzierbares Detektionssystem – analog eines Sandwich-ELISA – zum Tierart-spezifischen Nachweis in FKM bzw. Futtermitteln etabliert werden. Bei Erfolg der Methodik ist die Isolierung von anti-Osteocalcin-bindenden Peptiden gegen die relevanten Tierarten Rind/Schaf/Ziege, Schwein, Huhn sowie die Gruppe der Fische geplant, um ein effektives und routinegeeignetes Screeningverfahren für die simultane Überprüfung von Tierarten in Fleisch- und Knochenmehl und Futtermittelgemischen bereitzustellen. Das Potential einer quantitativen Methode ist bei dem gewählten Ansatz gegeben.

Drei verschiedene hitzestabile Proteine von unterschiedlicher Größe und Ladungseigenschaften (Fibrinopeptid b, Osteocalcin und Myoglobin) wurden in Phage-Display Experimenten mit kommerziellen Phagen-Bibliotheken (New England, Biolabs) eingesetzt. Ziel war die Identifizierung von Peptid-Bindern („Peptid-Aptamere“), welche spezifisch verarbeitete tierische Proteine als Zielmoleküle in Futtermitteln „erkennen“ und ähnlich einfach wie Antikörper im ELISA eingesetzt werden können. Das Ziel, derartige Peptid-Binder zu identifizieren, gelang mit den kommerziellen M13-Phagenbibliotheken (New England Biolabs) nicht. Die ermittelten Sequenzen nach den Panningrunden waren unspezifisch hinsichtlich der Zielmoleküle. Mögliche Ursachen hierfür können in der zu geringen Anzahl ausgewerteter Klone, in einem zu optimierenden Panning-Design aber auch in internen Fehlern der verwendeten Phagenbibliotheken begründet sein.

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