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In vitro Assay zur Detektion epigenetischer Effekte während der Differenzierung
Projekt
Förderkennzeichen: BfR-CPS-08-1322-695
Laufzeit: 01.01.2018
- 31.12.2018
Forschungszweck: Experimentelle Forschung
Die embryonale Entwicklung ist ein komplexer Vorgang, bei dem bereits kleinste Störungen erhebliche Auswirkungen auf den sich entwickelnden Organismus haben können. Bisher lag das Hauptaugenmerk bei der Testung von Teratogenität auf apikalen morphoplogischen Effekten. Dies gilt auch für eine der wenigen Testalternativen in vitro, dem embryonalen Stammzelltest (EST). Gleichzeitig ist aber in den letzten Jahren unser Verständnis möglicher zugrundeliegender epigenetischer Veränderungen während der Embryonalentwicklung gestiegen. Besonders gut untersucht ist dabei die DNA-Methylierung. Diese konzentriert sich auf Cytosine in CG-Dinukleotiden, was den Vorteil hat, dass sie so aufgrund der palindromischen Struktur während der Zellteilung einfacher aufrechterhalten werden kann. Die DNA-Methyltransferase 1 (Dnmt1) erkennt entsprechend hemi-methylierte DNA und modifiziert das entsprechende Cytosin am zweiten Strang. Direkt nach der Befruchtung werden die Methylierungsmuster des paternalen und maternalen Genoms allerdings einmalig entfernt und anschließend gewebsspezifisch durch die de novo DNA-Methyltransferasen 3a und 3b neu angelegt, so dass der Methylierungsgrad der Blastozyste sehr gering ist. Ausnahmen sind imprintete Bereiche und repetitive Elemente, hier bleibt die Methylierung während der Embryonalentwicklung konstant (50 bzw. 100%). Damit ist die Embryonalentwicklung besonders sensitiv für epigenetisch aktive Substanzen und deren gesundheitliche Einflüsse. Ein direkter mechanistisch-phänotypisch Zusammenhang für diese Prozesse steht noch aus, es existieren aber deutliche Korrelationen. Das beeindruckenste Beispiel ist der durch die NS-Besatzung erzwungene Hungerwinter in den Niederlanden am Ende des zweiten Weltkrieges. In dieser Zeit sanken die täglichen Rationen zum Teil unter 1000 kcal. Alle Personen, deren erstes Trimester in diese fiel weisen noch 60 Jahre später einen in einzelnen Bereichen um ca. 5 % reduzierten Methylierungslevel auf(~5 Prozentpunkte) und leiden gleichzeitig an einer erhöhten Suszeptibilität für Herzkreislauferkrankungen. Ebenso führen teratogene Modellsubstanzen wie Valproin- oder Retinsäure zu veränderten Methylierungsmustern und induzieren dadurch Effekte. Im vergangenen Berichtsjahr konnte aus dem Projekt 1322-593 heraus eine Methode etabliert werden, die methylierungssensitive Änderungen in vitro detektieren kann. Dazu wurden murine embryonale Stammzellen in Herzmuskelzellen differenziert und zu verschiedenen Zeitpunkten Proben genommen. Die dann isolierte DNA wurde mittels methylierungssensitiver Restriktion und qPCR an spezifischen Bereichen untersucht. Der Grundgedanke ist dabei, dass Bereiche zweier Kategorien untersucht werden. Die erste Kategorie sind genomische Abschnitte, deren Methylierungslevel konstant ist. Dazu wurden zunächst drei Stellen ausgesucht: 1. der Pgk1-Promoter, 2. die Imprinting-control-Region des Igf2-H19 Locus und 3. der IAP-Promoter. Als veränderlicher Bereich der 2. Kategorie wurde der Oct4-Promoter untersucht. Pgk1 ist ein Haushaltsgen, dass in allen Zellen stark exprimiert ist und dessen Promoter unmethyliert vorliegt. Der Igf2-H19 Locus ist ein imprinteter Bereich, und sollte deshalb eine Methylierung von 50% aufweisen. IAP (intracisternes A Partikel) schließlich ist ein ehemaliger Retrovirus, der durch die zelluläre Maschinerie konstant methyliert und damit inaktiviert wird. Oct4 ist ein Pluripotenzgen, dass in mESCs exprimiert, während der Differenzierung herunterreguliert und anschließend methyliert wird. Die bisherigen Versuche wurden mit Substanzen durchgeführt, für die eine mögliche Wirkung aus in vivo Studien mit Agouti-Mäusen bereits bekannt war. Besonders interessant ist dabei Bisphenol A, welches die allgemeine Methylierung des IAP-Promoters vor dem Agoutigen reduziert. Wir konnten einen solchen Effekt auch in vitro in den D3 mESCs nachweisen, wobei dieser Effekt jedoch interessanterweise konzentrationsunabhängig auftritt. Ein weiterer wichtiger Aspekt war die Reduktion der Methylierung des Igf2-H19 Locus durch Valproinsäure, die mit einer vermehrten Expression von H19 korreliert. Im Folgenden sollen die bisherigen Experimente nun mit komplementären Methoden und in einer zweiten Zelllinieu bestätigt, sowie weitere Targets indentifiziert werden. Letztendliches Ziel ist die Entwicklung eines Multiplexassays.
Epigenetische Veränderungen sind essentieller Teil der frühen Embryonalentwicklung. Es gibt genügend Hinweise, dass äußere Faktoren Einfluss auf epigenetische Mechanismen haben können, welche sich bis zu 60 Jahre später nachweisen lassen und einen Einfluss auf die Lebensqualität der Betroffenen haben. Deshalb wurde ein neuer Assay zur Detektion von Veränderungen des Methylierungsstatuses einzelner ausgesuchter Bereiche getestet. Dabei wurden als "proof of concept" sowohl genomische Bereiche analysiert die sich während der Differenzierung ändern, als auch solche die sich nicht ändern sollen. Ziel dieses Projektes war die Verifikation der bereits vorher erhaltenen Ergebnisse und die Analyse, ob sich die Methode zum Screening von potentiellen epigenetischen Noxen eignet. Auch wenn die ersten Ergebnisse sehr vielversprechend waren, erwies sich der Assay vor anderen genetischen Hintergründen als nicht hinreichend stabil und zu fehleranfällig. Von einer weiteren Entwicklung wird daher abgesehen. Die erhaltenen Daten fließen in die weiteren laufenden Projekte zu epigenetischen Noxen und deren möglicher Detektion in vitro ein.
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Biotechnologie
- Genetische Ressourcen
- Toxikologie
Rahmenprogramm
Förderprogramm
Ausführende Einrichtung
BfR - Abteilung 7: Chemikalien- und Produktsicherheit (BfR - CPS)
