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Speziesspezifität exogener und endogener Arylhydrocarbonrezeptorliganden

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: BfR-CPS-08-1322-697
Laufzeit: 01.08.2018 - 31.12.2018
Forschungszweck: Experimentelle Forschung

Der Arylhydrokarbonrezeptor (AHR) ist ein ligandenaktivierter Transkriptionsfaktor, der eine bedeutende Rolle in der molekularen Toxikologie spielt. Bei Bindung von exogenen Schadstoffen wie Dioxinen, polyzykliklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK)oder polychlorierten Biphenylen (PCBs) an den AHR dissoziiert dieser vom den zytosolischen Chaperonkomplex , transloziert in den Zellkern, wo er an seinen heteromeren Partner ARNT (AHR nuclear translocator) bindet. Dieses Heterodimer bindet dann wiederum an spezifische DNA-Sequenzen (xenobiotic response elements, XREs) in den Promotoren der AHR Zielgene, um deren Transkription zu initiieren bzw. zu verstärken. Zu diesen gehören unter anderem Gene des Fremdstoffmetabolismus wie z.B. CYP1A1 und CYP1B1, die z.T. auch für eine Autoregulation des Systems sorgen. So führen Liganden die gleichzeitig Substrate des AHR-Regulons sind nur zu einer transienten Aktivierung des AHR, ganz im Gegensatz zu beispielsweise PCBs und Dioxinen, die keine CYP-Substrate sind und den AHR permanent aktivieren. Der AHR gehört zur Proteinfamilie der basic region helix-loop-helix-PER/ARNT/SIM (bHLH-PAS) Proteine. Er besitzt eine aminoterminale DNA-Bindungsdomäne, eine Ligandenbindungsdomäne (LBD), die auch eine Rolle bei verschiedenen Protein-Protein-Interaktionen spielt, sowie eine carboxyterminale Q-reiche Transaktivierungsdomäne. Neben einer sehr ausgeprägten Ligandenspezifität zeigt der AHR auch eine starke Speziesspezifität. So sind seit Jahrzehnten dramatische Unterschiede bei der AHR-vermittelten Toxizität von TCDD bekannt. Hier ist z. B. das Meerschweinchen 5000mal sensitiver als der Hamster, Maus und Ratte liegen dazwischen. Das mag zum Einen an der verschiedenen Verteilung von XREs im Genom liegen, zum Anderen liegt es aber auch an Sequenzunterschieden im AHR selbst. Besonders hervorzuheben ist hierbei der Austausch eines Valins zu Alanin in der LBD, der zu einer geringeren Affinität des humanen Rezeptors gegenüber Dioxinen und PAHs, verglichen mit dem murinen AHR, führt (zusammengefasst in Denison et al., 2011). Mitursächlich dürfte hier sein, dass der AHR neben seiner Rolle im Fremdstoffmetabolismus auch wichtige physiologische und entwicklungsbiologische Funktionen übernimmt. So reguliert der AHR wichtige Funktionen im Energie- und Lipidmetabolismus, im Zellzyklus und bei bestimmten Immunfunktionen. Vor allem in Organen mit Barrierefunktion (z. B. Haut, Lunge und Darm) ist diese Doppelfunktion des AHR von besonderer Wichtigkeit (Esser und Rannug, 2015). Hier spielen auch Liganden eine Rolle, die entweder endogen oder vom Mikrobiom synthetisiert werden. Besonders Metabolite des Tryptophan- und des Indolmetabolismus sind bekannte, schnell metabolisierbare AHR Liganden. Der Farbstoff Indirubin ist einer der potentesten AHR-Liganden, der sogar eine geringere EC50 als TCDD aufweist. Zumindest gilt dies für den humanen AHR (hAHR), wohingegen die Substanz am murinen AHR (mAHR) mehr als 100fach schwächer wirkt (Flaveny et al. 2009). Auch für Indoxylsulfat und Kynurenin wurde eine Speziesselektivität am hAHR beschrieben. Die molekularen Ursachen dafür sind bislang nicht bekannt. Lediglich der Valin zu Alanin Austausch konnte kürzlich ausgeschlossen werden, da die Mutation dieser Aminosäure nicht zu einer veränderten Affinität des hAHR für Indirubin, Indol und Indoxylsulfat führt (Hubbard et al., 2016). Indirubin selbst konnte auch in humanem Serum und Urin nachgewiesen werden (Adachi et al., 2001). Die starke Speziesspezifität des AHR hat direkte Auswirkungen auf speziesspezifische Toxizität. Ein besseres Verständnis und eine bessere Einschätzung dieser Effekte sind daher wichtig für die Hazard- und Risikobewertung von Stoffen. In diesem Projekt soll nun anhand von Indirubin als Modellmetaboliten ermittelt werden, welche molekularen Determinanten für Speziesselektivität endogener/exogener Liganden verantwortlich sind. Das Projekt ergänzt damit die bereits am BfR laufenden Studien zum AHR.

Der Arylhydrocarbonrezeptor spielt eine wichtige Rolle Fremdstoffmetabolismus. Verglichen mit dem humanen AHR lässt sich das murine Ortholog durch anthropogene Kontaminanten wie TCDD, PCBs und PAKs stärker aktivieren. Endogene Liganden wie Indirubin oder Indol hingegen besitzen eine stärkere Affinität zum hAHR. Um die für diesen Unterschied ursächlichen Aminosäuren zu bestimmen, wurden verschiedene Hybride AHR Konstrukte erstellt. So wurde im hAHR dies gesamte Ligandenbindungsdomäne mit der murinen substituert (Hybrid 1), des weiteren wurden Konstrukte kloniert, bei denen jeweils der amino- bzw. der carboxyterminale Teil der LBD ausgetauscht wurden (Hybrid 2 und 3). Als Transfektionshost wurde eine eigens dafür generierte ΔAHR-MCF7 Zellen verwendet. Die transient transfizierten Zellen wurden dann mit TCDD oder Indirubin stimuliert und die Expression des AHR Targetgens CYP1A1 mittels qPCR bestimmt. Obwohl wie erwartet hAHR durch Indirubin stärker aktiviert wurde als mAHR, waren die Ergebnisse für die Hybride nicht so eindeutig. Alle Hybride wurden durch Indirubin stärker als mAHR aktiviert, Hybrid 2 und Hybrid 3 sogar stärker als hAHR. Aufgrund dieser Ergebnisse kann geschlossen werden, dass die LBD offensichtlich nicht der alleinige determinierende Faktor für die Speziesunterschiede für die Indirubinaffinitäten ist.

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