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Kombination eines mikrophysiologischen Systems mit einem trägerfreien 3D Organoid als entwicklungsbiologisches Modell für die Ossifikation

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: BfR-ZEBET-08-1322-706
Laufzeit: 01.07.2017 - 31.12.2019
Forschungszweck: Experimentelle Forschung

Zweidimensionale(2D) Zellkultursysteme sind nur bedingt geeignet, um komplexe Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Zelltypen, Organen und Geweben höherer Organismen abzubilden. Gewebsspezifische Parameter wie der Sauerstoffpartialdruck, die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix aber auch spezifische mechanische Kräfte können im Monolayer nur schwer nachempfunden werden. Die Folge ist, dass Erkenntnisse konventioneller Zellkulturverfahren oft nur unter Vorbehalt auf komplexere Organismen übertragen werden können. Besonders in der regenerativen Medizin und in der Toxikologie stellt die eingeschränkte Übertragbarkeit ein Problem dar, deshalb werden nach wie vor eine Vielzahl tierexperimenteller Versuche durchgeführt. Neben ethischen Überlegungen, wird vor allem die Translation von Ergebnissen aufgrund spezies-spezifischer Unterschieden als Limitation des Tierversuches gesehen. Eine Möglichkeit die oben genannten Nachteile zu umgehen, ist die Verwendung von Organ-on-Chip-Modellen. Das sind mikrofluidische Systeme, die es ermöglichen die physiologischen Parameter bestimmter Gewebe nachzuempfinden und eine Co-Kultivierung verschiedener Zelltypen in zwei oder drei Dimensionen (3D) erlauben. Verschiedene Organ-on-a-Chip-Systeme wie Lunge, Leber oder Niere sind bereits publiziert. Es gibt jedoch kein physiologisch relevantes Knochen-auf-dem-Chip-Modell, das alle Schlüssel-Parameter, welche die Funktion des Knochens bestimmen, berücksichtigt. Zusätzlich zu seiner motilitätsbezogenen Funktionen im muskuloskeletalen System befindet sich im Knochen die hämatopoetische Stammzell (HSC) –Nische. Diese ist von essentieller Bedeutung bei der Bildung des Blut- und Immunsystems. Mittels konventioneller Zellkultur ist es nur bedingt möglich den HSC-Phänotyp inklusive stammzelltypischer Eigenschaften zu erhalten. Der Grund dafür ist, dass komplexe Wechselwirkungen mit mesenchymalen Stromazellen (MSCs) und gefäßbildendenden Zellen, sowie die Präsenz von Sauerstoffgradienten nur schwierig nachempfunden werden können. Weiterhin herrscht in vivo im Knochen eine stetige Remodellierung, ein Prozess, der durch eine kontinuierliche Resorption und Neubildung von Gewebe gekennzeichnet ist. Hierbei interagieren knochenbildende Osteoblasten (OBs) und knochenresorbierende Osteoklasten (OCs) aufgrund einer Stimulation durch externe Signale wie zum Beispiel mechanische Belastung. In diesem Projekt wird ein mikrophysiologisches Knochen-auf-dem-Chip-System entwickelt, dass eine mikrofluidische Plattform und ein Gewebeanalogon umfasst, um die physiologischen Parameter und die zelluläre Komposition des Knochens nachzuempfinden. Das Gewebeanalogon soll aus primären Zellen (humane MSCs und/oder humane OBs), trägerfrei erzeugt werden. Die Primärzellen werden aus Knochenmarksflüssigkeit und Knochengewebe isoliert und anschließend expandiert. Das Primärmaterial wird durch eine Kooperation mit den DRK-Kliniken Westend bereitgestellt. Da es sich bei dem Material um Proben verschiedener Patienten handelt, ist von einer hohen Variabilität zwischen den einzelnen Spendern auszugehen. Um diese möglichst gering zu halten, werden beide Zelltypen im Hinblick auf ihre Stoffwechselaktivität, Proliferationsrate und Phänotypen charakterisiert. MSCs und OBs werden auf ihr Differenzierungspotential in die osteogene, adipogene und chondrogene Richtung untersucht. Die Zellen der verschiedenen Spender werden anhand dieser Daten gruppiert. Im Anschluss werden Gewebe-Analoga nur aus Zellen von Spendern mit ähnlichen Eigenschaften generiert. Nach erfolgreicher Etablierung des Organiods aus OBs und dessen Adaption an das mikrophysiologische System, wird im Verlauf des Projektes ein Co-Kultursystem aufgebaut. Hierbei sollen OBs gemeinsam mit MSCs wie unter in vivo Bedingungen als Organoid im Chip kultiviert werden. Um die Knochenremodellierung nachzuempfinden werden ferner knochenresorbierende OCs benötigt. Diese differenzieren entweder selbstständig aus Makrophagen und damit der hämatopoetischen Linie, also den HSCs, die dem Organoid hinzugefügt werden, oder werden im Anschluss in Form einer kommerziell erhältlichen Zelllinie dem Organoid hinzugefügt. Die HSCs werden ähnlich den MSCs aus der Knochenmarksflüssigkeit isoliert. Um den Knochen möglichst genau nachempfinden zu können ist schließlich eine Vaskularisierung des Gewebeanalogons notwendig, um eine Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen auch innerhalb des Organoids zu optimieren. Nach erfolgreicher Etablierung aller Parameter soll der Knochen-auf-dem-Chip neben der Anwendung als entwicklungsbiologisches Modell für die Ossifikation auch für toxikologische Fragestellungen (z.B. die Untersuchung teratogener Substanzen) genutzt werden.

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