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Etablierung, Validierung, Verifizierung und Akkreditierung moderner, effizienter, hochsensitiver und hochspezifischer Verfahren zum sicheren Nachweis von Pflanzenviren und -viroiden
Projekt
Förderkennzeichen: A/15/14, 5459
Laufzeit: 01.03.2015
- 30.11.2018
Forschungszweck: Angewandte Forschung
Die gezielte Schaderregerbekämpfung ist wesentlicher Bestandteil des integrierten, ressourcenschonenden Pflanzenbaus. Eine gezielte Bekämpfung ist aber nur möglich, wenn die Schadursache zweifelsfrei geklärt ist. Als Beratungsgrundlage hinsichtlich zu ergreifender Bekämpfungsmaßnahmen ist deshalb in der Regel eine Labordiagnose unumgänglich; dies trifft vor allem zu, wenn es sich um Virus- und Viroid-bedingte Krankheiten handelt, die visuell nicht diagnostizierbar. Labordiagnosen sind zudem unverzichtbar bei Untersuchungen im Rahmen des Hoheitsvollzuges wie auch beim Monitoring von Schaderregern. Vor dem Hintergrund der zunehmenden Anzahl an Viren und Viroiden, der Vielzahl neu auftretender unterschiedlicher Erregerstämme sowie der Forderung nach einem sicheren und schnellen Erregernachweis gilt es, das an der LfL zur Verfügung stehende Methodenspektrum weiter systematisch auszu¬bau¬en, die Verfahren zu optimieren, sicherer zu machen und für die Routineanwendung anzupassen, um den an die Diagnose gestellten Anforderungen auch künftig gerecht zu werden und die bisherige Spitzenposition Bayerns in der Diagnostik zu erhalten. Wesentlich bei jeglicher Diagnose ist die Akzeptanz der Untersuchungsergebnisse durch Dritte; besonders wichtig ist dies beim Nachweis von Quarantäneschaderregern; hier müssen die Ergebnisse ggf. auch vor Gericht Bestand haben, also justiziabel sein. Voraussetzung für Akzeptanz und Justiziabilität der Ergebnisse ist die Anwendung validierter und verifizierter Nachweisverfahren, die nach der international geltenden Norm DIN EN ISO 17025 akkreditiert sind. Die Akkreditierung wird verpflichtend für die Diagnoselabore durch die Neufassung des EU-Regelungssystems im Bereich Pflanzengesundheit und die damit verbundene Novellierung der bisherigen „VERORDNUNG (EG) Nr. 882/2004 DES EUROPÄISCHEN PARLAMENTS UND DES RATES vom 29. April 2004 über amtliche Kontrollen zur Überprüfung der Einhaltung des Lebensmittel- und Futtermittelrechts sowie der Bestimmungen über Tiergesundheit und Tierschutz“, in die auch die Pflanzengesundheit integriert wird. Die Umsetzung der novellierten Verordnung hat binnen eines Zeitraums von 5 Jahren zu erfolgen (voraussichtlich bis zum Jahr 2018), sodass ein Zeitdruck besteht, der zügiges Handeln erfordert. Die EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization) hat mit dem EPPO-Standard PM 7/98 Specific requirements for laboratories preparing accreditation for a plant pest diagnostic activity” einen umfassenden, für alle Diagnoselabore verbindlichen Standard auf den Weg gebracht, der detailliert die äußerst umfangreichen, zeit- und arbeitsintensiven Maßnahmen zur Validierung und Verifizierung von Nachweismethoden festlegt. Der Standard ist mittlerweile auch von der DAkkS (Deutsche Akkreditierungsstelle) als verbindliches Dokument 71 SD 4 029 ''Besondere Anforderungen für Laboratorien, die die Akkreditierung für die Diagnose von Schadorganismen von Pflanzen anstreben'' übernommen worden. Alle neu etablierten, aber auch alle bereits vorhandenen und routinemäßig in der Pflanzengesundheit eingesetzten Diagnoseverfahren müssen demnach umfänglich validiert und verifiziert sein. Im beantragten Projekt geht es deshalb um die (1) Etablierung neuer, hochspezifischer, hochsensitiver und schneller molekularbiologischer Nachweisverfahren für bekannte und neue Erreger, insbesondere für Erreger, für die keine alternativen Methoden verfügbar sind oder deren Nachweis mit alternativen Methoden zu zeitaufwändig ist. (2) Validierung und Verifizierung neuer wie auch vorhandener Nachweisverfahren. (3) Vorbereitung der Akkreditierung und Akkreditierung von Nachweisverfahren, insbesondere für Quarantäneschaderreger - vor dem Hintergrund der Neufassung EG-Verordnung Nr. 882/2004 Konkrete Ziele des beantragten Projekts: Etablierung, Validierung und Verifizierung - von RT-PCR- und Realtime-RT-PCR-Verfahren zum Nachweis des Quarantäneschaderregers Potato spindle tuber viroid und anderer Pospiviroide (teilweise ebenfalls Quarantäneschaderreger) an Solanaceen - eines Realtime RT-PCR-Nachweises für den Quarantäneschaderreger Pepino mosaic potexvirus von RT-PCR- und Realtime-RT-PCR-Verfahren für ausgewählte andere Viren (z.B. Tomatenbronzefleckenvirus, Scharkavirus) - Etablierung und Erprobung von RT-PCR-Verfahren in der Praxis zum Nachweis neuer gefährlicher, wirtschaftlich relevanter Pathogene an Hopfen: Hop stunt viroid, Citrus viroid IV - zur Detektion von Quarantäne-Phytoplasmen, insbesondere von Stolbur-Phytoplasmen an Kartoffel und Apfeltriebsucht-Phytoplasmen - zum gruppenspezifischen Nachweis von Carlaviren am Beispiel des Hopfens - zum gruppenspezifischen Nachweis von Gelbverzwergungsviren (Luteoviren) bei Getreide - Etablierung einer RT-PCR- und einer Realtime-RT-PCR-Nachweismethode für das aktive Petunia vein clearing virus als Modellsystem für den Nachweis eines endogenen Pararetrovirus (neuartige, wirtschaftlich bedeutsame Viren an Zierpflanzen wie Petunia sp., Calibrachoa sp.) und zum Nachweis des Blackcurrant reversion nepovirus an Schwarzer Johannisbeere für das bundesweit keine schnelle Nachweismethode zur Verfügung steht. Übergeordnetes Ziel: Flexible Akkreditierung der RT-PCR und Realtime RT-PCR zum generellen Nachweis von Pflanzenviren und –viroiden in pflanzlichem Material Forschungsplan/Arbeitsprogramm 1) Recherchen zu den relevanten, erfolgversprechenden Nachweistechniken und vorhandenen Validierungsdaten 2) Sammeln und Bereitstellung von Referenzmaterial, insbesondere für neue Erreger (z. B. Hop stunt viroid, Citrus viroid IV, Petunia vein clearing virus, Black currant reversion virus) 3) Etablierung und Durchführung von Infektionsversuchen im Gewächshaus zur Vermehrung und Produktion von definiertem Refe¬renz¬material 4) Erarbeitung neuer, präziser molekularbiologischer Diagnosemethoden (RT-PCR, Realtime-RT-PCR) für • neu auftretende Erreger: Hop stunt viroid, Citrus viroid IV, Petunia vein clearing virus • bereits verbreitet vorkommende Erreger: Apfeltriebsucht- und Stolbur-Phytoplasmen, Pospiviroide an Kartoffeln und anderen Solanaceen, Luteo-Verzwergungsviren bei Getreide; Carlaviren, z. B. Hopfenmosaikvirus, Latentes Hopfenvirus, Amerikanisches Hopfenvirus; Blackcurrant reversion virus an Schwarzer Johannisbeere 5) Anwendung und Praxiserprobung der neuen Techniken im Rahmen von Montoringprogrammen auf • Hop stunt viroid, Citrus viroid IV und Carlaviren im Rahmen des deutschlandweiten Virus- und Viroidmonitorings an Hopfen (die Kofinanzierung des Monitorings 2015 durch die Wissenschaftliche Station für Brauerei in München e.V. mit 6.000 Euro ist im Kostenplan berücksichtigt) • Luteo-Verzwergungsviren an Getreide im Rahmen des jährlich bayernweit in Kooperation mit den Ämtern für Ernährung, Land¬wirt¬schaft und Forsten (ÄELF) durchgeführten Virusmonitorings 6) Ausarbeitung von Validierungs- und Verifizierungsplänen für ausgewählte Methoden und Zielorganismen in definierten Matrizes (z. B. RT-PCR und Realtime RT-PCR für Pospiviroide und Pepino mosaic virus in Blattmaterial von Solanaceen) basierend auf dem grundlegenden EPPO-Standard PM 7/98(2) bzw. dem DAkkS-Dokument 71 SD 4 029 7) Methodenvalidierung und -verifizierung: Durchführung der Versuche gemäß den Validierungs- und Verifizierungs¬plänen 8) Auswertung und Erstellung von Berichten zu den Validierungs- und Verifizierungsversuchen als Vorbereitung für die Akkreditierung 9) Verfassen von Arbeits- und Verfahrensanweisungen für den Nachweis der verschiedenen Viren und Viroide als Vorbereitung für die Akkreditierung 10) Publikation: Einstellung der Validierungsdaten in die Datenbank der EPPO 11) Teilnahme an EU- und bundesweiten Ringtests und Laborvergleichsuntersuchungen zur Überprüfung und Bestäti¬gung der eigenen diagnostischen Kompetenz und der Leistungsfähigkeit insbesondere der neu erarbeiteten und neu etablierten Me¬thoden 12) Organisation und Auswertung von Ringtests und Laborvergleichsuntersuchungen 13) Flexible Akkreditierung der RT-PCR und Realtime RT-PCR zum allgemeinen Nachweis von Pflanzenviren und -viroiden in Blattmaterial.
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Pflanzenschutz
