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Geschlechtsdeterminierung in Schweinen mittels CRISPR/Cas (Gene-Editing Pigs)
Projekt
Förderkennzeichen: FLI-ING-08-HM-0003
Laufzeit: 01.04.2017
- 30.10.2020
Forschungszweck: Experimentelle Forschung
Ziel dieses Projekts ist es die Möglichkeit der Beeinflussung der Geschlechtsdeterminierung mittels CRISPR/Cas im Hausschwein und die Funktion des SRY-Gens im Hausschwein zu erforschen. Hierzu erforschen wir zunächst die Bedeutung des Y-chromosomal lokalisierten SRY-Gens in der Geschlechtsdeterminierung beim Schwein. Ein CRISPR/Cas Expressionsvektor welcher das SRY-Gen attackiert wird zunächst in männliche Schweinefibroblasten transfiziert und anschließend die Mutationsrate in diesem Locus analysiert. Genetisch modifizierte Zellen werden anschließend im somatischen Kerntransfer für die Generierung lebender Nachkommen eingesetzt und die Auswirkung auf die Geschlechterverteilung genau untersucht. Hierbei erwarten wir aufgrund von publizierten Mausexperimenten bei einem erfolgreichen Ausschalten des SRY-Gens genotypische männlichen Nachkommen, die einen weiblichen Phänotyp bei den äußeren und inneren Geschlechtsmerkmalen aufweisen. In einem zweiten Schritt wird ein integrativer CRISPR/Cas Vektor konstruiert, der in das Y-Chromosom gezielt integriert wird. Dieses Konstrukt wird von einem Spermatogenese-spezifischen Promoter angetrieben und wird mehrere Bereiche des Y-Chromosoms angreifen. Dieses Vorgehen soll dazu führen, während der Spermatogenese eine vollständige Zerstörung des Y-Chromosoms zu erzielen, sodass lediglich X-chromosomale Spermien generiert werden, die bei der Verpaarung eines in dieser Art genetisch-modifizierten Ebers, zur Geburt ausschließlich weiblicher Nachkommen führt. Dieses Projekt befasst sich hauptsächlich mit Grundlagenforschung die Hauptfunktion des SRY-Gens in Schweinen aufzuklären, könnte aber auch Probleme adressieren, die aus dem Verbot der betäubungsfreien Kastration unter 8 Tage alter Ferkel in der EU ab 2019 resultieren.
Mit Hilfe der CRISPR/Cas Genschere konnten über Mikroinjektion in Schweineembryonen Mutationen im SRY-Gen des Schweines und lebende Nachkommen mit der Mutation erzeugt werden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass das SRY-Gen eine entscheidende Rolle in der Geschlechtsbestimmung beim Schwein spielt. Männliche Tiere, bei denen das SRY-Gen durch die Mutation ausgeschaltet war, zeigten einen weiblichen Phänotyp mit äußeren und inneren weiblichen Geschlechtsmerkmalen (Vulva, Eierstöcke und Gebärmutter). Die Ergebnisse dieses Projekts konnten die Mechanismen der Geschlechtsbestimmung beim Schwein weiter aufklären und einen Weg aufweisen wie das Geschlecht von Nachkommen in der Nutztierzucht über molekularbiologische Methoden beeinflusst werden könnte.
Entstandene Publikationen:
S. Kurtz, B. Petersen, Pre-determination of sex in pigs by application of CRISPR/Cas system for genome editing. Theriogenology 137, 67-74 (2019).
S. Kurtz et al., The knockout of the HMG-Domain of the porcine SRY-gene by CRISPR/Cas RNP microinjection causes sex reversal in gene-edited pigs. bioRxiv, 617589 (2019). (Dieser Preprint ist zur Zeit bei PNAS under review)
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Tierzucht
