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Authentizität und Herkunftsnachweis von Fischerei-Erzeugnissen durch Protein- und DNA-Analyse

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: MRI-MF-08-66
Laufzeit: 01.08.2008 - 30.06.2019
Forschungszweck: Grundlagenforschung

Entwicklung und Validierung von Methoden zur Tierart-Bestimmung und zum Herkunftsnachweis von Fischerei-Erzeugnissen. Die bis vor 15 Jahren üblichen Protein-Elektrophoresemethoden werden nahezu vollständig durch PCR-basierte Verfahren der DNA-Analyse ersetzt. Die DNA-Analyse lässt sich auf alle Erzeugnisse anwenden und ermöglicht auch die Differenzierung genetisch sehr nahe verwandter Tierarten. Die entwickelten Methoden werden in der amtlichen Lebensmittelüberwachung, aber auch bei der Wareneingangskontrolle bei Industrie und Handel eingesetzt.

Mit Blick auf die Ciguatoxin-Problematik sollte ein molekularbiologisches Analysenverfahren wie die real-time PCR entwickelt werden, das die schnelle und spezifische Identifikation von relevanten Snapper-Arten, wie den Doppelfleckschnapper Lutjanus bohar, der oftmals mit Ciguatera-Krankheitsfällen in Verbindung gebracht wird, nachzuweisen. Die real-time PCR, auch qPCR genannt, ist ein übliches Verfahren, das in allen gut ausgestatteten molekularbiologischen Laboren für verschiedenste Anwendungen eingesetzt wird und sich daher auch für den spezifischen Nachweis von Snapper-Arten eignet. Im Gegensatz zur PCR-Sequenzierung, die eine Probenbearbeitung je nach Laborausstattung von drei bis fünf Tagen erfordert, erlaubt die qPCR einen relativ schnellen Speziesnachweis innerhalb von wenigen Stunden bei einem hohen Probendurchsatz und eignet sich daher sehr gut als Screening-Methode, um beispielsweise verdächtige Proben bei einer größeren Container-Sendung oder einem umfänglichen Lebensmittel-Monitoring zu analysieren. Da es zur Zeit noch keine geeignete Nachweismethode für Ciguatoxine in Fischereierzeugnissen gibt, kann die in diesem Projekt entwickelte qPCR als Schnellverfahren zum spezifischen Nachweis relevanter Snapper-Arten einen zusätzlichen Beitrag zum effektiven Verbraucherschutz leisten. Ziel war es, eine multiplex qPCR-Methode zur Bestimmung von L. bohar, L. argentimaculatus und der häufig substituierten Art L. malabaricus (Red Snapper) zu entwickeln und zu validieren, um sie zukünftig als Standardmethode in den Kontrolllaboratorien zu etablieren. Als Grundlage für die zu prüfenden Parameter und zur Inhouse-Validierung dienten die CODEX Guidelines CAC/GL 74-2020 und die BVL-Leitlinien zur Einzellabor-Validierung qualitativer real-time PCR Methoden. Für die drei Snapper L. bohar, L. argentimaculatus und L. malabaricus wurden spezifische Primer / Taqman Sonden-basierte Systeme anhand veröffentlichter COI DNA-Sequenzen in GenBank/ NCBI Nucleotide, BOLD Systems und der FDA-Datenbank Reference Standard Sequence Library (RSSL) entwickelt, die zunächst in silico, dann in praktischer Anwendung einzeln und schließlich im Multiplex-Ansatz geprüft wurden. Für das Nachweissystem zur positiven Kontrolle, das die grundsätzliche Funktion der durchgeführten qPCR bestätigt, wurden die Primer- und Sonden-Sequenzen aus der Literatur entnommen. Zur Sicherstellung, dass alle drei entwickelten Systeme ohne Inhibierung und Bildung verschiedenster Nebenprodukte in der Multiplex-Anwendung arbeiten, wird beispielsweise in den BVL-Leitlinien eine Effizienz innerhalb der geforderten Grenzen von 90 – 110% gefordert. Für alle drei Systeme konnte eine gute bis sehr gute Effizienz von 96,0 bis 102,6 % erreicht werden. Um die Spezifität der Methode nachzuweisen, wurden neben den Zielarten verschiedene Snapper-Arten aus der Familie der Lutjanidae und auch andere Arten wie beispielsweise Rot- oder Zackenbarsche analysiert, die in der Vergangenheit als Substitute für den Red Snapper in der Literatur genannt oder auch als Markt- und Grenzkontrollproben nachgewiesen worden sind. Einige Landesbehörden in Deutschland (Institut für Hygiene und Umwelt in Hamburg, Bayerisches Landesamt für Gesundheit und Lebensmittelsicherheit (LGL), Landesbetrieb Hessisches Landeslabor (LHL) Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES) in Cuxhaven) als auch das Fischinformationszentrum in Hamburg (FIZ) haben das Projekt unterstützt, indem sie Snapper-Proben und Substitute zur Verfügung gestellt haben. Die Vielzahl an bisher analysierten Fischerzeugnisse beweist, dass die entwickelte multiplex qPCR-Methode sich zum spezifischen Nachweis der drei o.g. Ziel-Arten eignet. Bei einigen Nicht-Zielarten treten zwar teilweise im späteren Cq-Bereich Fluoreszenzsignale auf, diese sind jedoch von dem Signal der jeweiligen Zielart dennoch sehr gut unterscheidbar. Zur Validierung einer qualitativen qPCR-Methode erweist sich die Bestimmung der Nachweisgrenze (LOD) als sinnvoll, um die Grenzen der Methode aufzuzeigen. Auch hier konnten gute bis sehr gute Ergebnisse mit 0,25 pg / µl im qPCR-Ansatz erzielt werden. Allerdings wird die LOD durch die nicht spezifischen Signale (cross reactions) einiger Nichtzielarten im späteren Cq-Bereich auf 2,5 pg / µl Ansatz eingeschränkt. Die Ergebnisse zur Überprüfung zum „Cross talk“, bei dem mindestens zwei verschiedene Zielarten in gleichen Konzentrationen, und zur asymetrischen qPCR, bei der zwei verschiedene Zielarten mit großen Konzentrationsunterschieden im Probenansatz enthalten sind, können für das qualitativ ausgerichtete multiplex qPCR-System als zufriedenstellend angesehen werden. Mit den Untersuchungen zur Robustheit, indem verschiedene PCR-Parameter, wie Annealing-Temperatur, Konzentrationen der eingesetzten Reagenzien wie Primer, Sonden, Polymerase-Mastermix oder der Einsatz eines anderen qPCR-Kits variiert wurden, konnte gezeigt werden, dass die drei Primer/ Sonden-Systeme relativ konstante Cq-Ergebnisse mit nur geringfügigen Schwankungen aufweisen. Die erfolgreiche Inhouse-Validierung der entwickelten multiplex qPCR-Methode zum spezifischen Nachweis der drei marktrelevanten Snapper-Arten (L. bohar, L. argentimaculatus und L. malabaricus) bescheinigt ein robustes Verfahren, das in den Kontrolllaboren zukünftig eingesetzt werden könnte. 1. Quinteiro, J.; Santaclara, F.J.; Rehbein, H.: Chapter 6: Authenticity of canned Seafood, in: Cabado, A.G.; Vieites, J.M.: Quality parameters in canned seafoods (2008)135-158 2. Rehbein, H.: Chapter 17: DNA-based methods, in: Fishery Products - Quality, safety and authenticity (Rehbein, H., Oehlenschläger, J., Hrg.); Wiley-Blackwell Publishing Ltd., Chichester. 2009, 363-387 3. Rehbein, H.; Müller-Hohe, E.; Hanel, R.: Falsche Fische - ein Bericht über die Schwierigkeiten der Identifizierung einer "Seezunge". Inf. Fischereiforsch.; 56. 2009, 35-40 4. Rehbein, H.; Oehlenschläger, J.: Buch: Fishery Products - Quality, safety and authenticity (Rehbein, H., Oehlenschläger, J., Hrg.); Wiley-Blackwell Publishing Ltd., Chichester. 2009 5. Rehbein, H.: Chapter 5: Single-Stranded Conformation Polymorphism Analysis, in: Popping, B.; Diaz-Amigo, C.; Hoenicke, K.: Molecular Biological and Immunological Techniques and Applications for Food Chemists. John Wiley. 2010, 105-117 6. Rehbein, H.: Chapter 11: Aquatic Food, in: Popping, B.; Diaz-Amigo, C.; Hoenicke, K.: Molecular Biological and Immunological Techniques and Applications for Food Chemists. John Wiley. 2010, 209-219 7. Rehbein, H.: Identifizierung der Welsart in Filetware durch Protein- und DNA-Analyse. Inf. Fischereiforschung; 58. 2011, 35-41 8. Rehbein, H.; Näumann, G.; Stumme, B.: Differenzierung von Pangasius (Pangasius hypophthalmus) und Asiatischem Rotflossenwels (Hemibagrus wyckioides) durch Protein- und DNA-Analyse. Inf. Fischereiforschung; 58. 2011, 13-19. 9. Rehbein, H.: Chapter 14: New trends in species identification of fishery products, in:Alasalvar, C.; Shahidi, F.; Miyashita, K.; Wanasundara, U.; Handbook of Seafood Quality, Safety and Health Applications. Blackwell Publishing. 2011, 171-180 10. Rehbein, H.; Hanel, R.: Fischverwirrung. J Culinaire; 15. 2012, 118-124 11. Rehbein, H.; Köppel, R.; Hankeln, T.: Leitfaden für die Lebensmittelüberwachung zur Identifizierung der Fischart durch DNA-Sequenzierung von PCR-Produkten. J Verbr. Lebensm. 7 (2012) 255-260 12. Näumann, G.; Stumme, B.; Rehbein, H.: Differenzierung von Kammmuscheln durch DNA-Analyse. 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Lopata (2011): Presence of parvalbumin in different tissues of three sturgeon species (Acipenser baerie, A. gueldenstaedtii, A. ruthenus). Journal of Applied Ichthyology, 27, 219-225 17. H. Rehbein and A. C.M. Oliveira (2012): Alaskan flatfishes on the German market: part 1: Identification by DNA and protein analytical methods. Eur. Food Res. Technol., 234, 245-251 18. K. Schiefenhövel and H. Rehbein (2013); Differentiation of Sparidae species by DNA sequence analysis, PCR-SSP and IEF of sarcoplasmic Proteins. Food Chemistry, 138, 154-160. Doktorarbeit von Fr. Dr. Schiefenhövel: Differentiation and Identification of Tropical and Subtropical Fish and Crustacean Species in Fishery and Aquaculture Products by Protein- and DNA-analytical Methods, 2011 H. Rehbein und K. Schiefenhövel (2012): Evaluation of a rapid PCR PCR-based method for species identification of raw and processed fish and shrimps. Journal of Aquatic Food Product Technology, 21, 86-96 19. Für Kabeljau, Hering und Flunder wurden Mikrosatelliten-PCR-Systeme entwickelt; sie werden zurzeit zur Untersuchung verschiedener Fangproben aus Nord- und Ostsee eingesetzt. Es wurde ein Abschlussbericht zum Projekt FK 3-1329-071 (Laufzeit vom 01.10.2007 bis zum 30.09.2008) des BFR angefertigt: Differenzierung von Beständen der Fischarten Hering, Kabeljau und Flunder aus verschiedenen Fanggebieten der Ostsee und der Nordsee (H. Rehbein und M. Klempt) K. Behrmann, M. Fischer, H. Rehbein; I. Haase: DNA-Extraktion für die SSR-PCR aus Heringserzeugnissen. Vortrag auf dem 41. Deutscher LM- Chemikertag, GDCh, 10.-12. 09 in Münster. Annika Fritsch, K. Behrmann, J. Fritsche, H. Rehbein: Differenzierung von Seelachsbeständen mit Hilfe der EPIC-PCR. Vortrag auf der Regionaltagung Nord der GDCh, Hamburg School of Food Science, 18.02.2013 K. Behrmann, A. Fritsch, H. Rehbein, M. Fischer: Methodenentwicklung zu Bestandsdifferen-zierung von Seelachs. Vortrag auf der Regionaltagung Nord der GDCh, Hamburg School of Food Science, 19.02.2013 Masterarbeit: Annika Fritsch: Differenzierung von Seelachsbeständen mit Hilfe der EPIC-PCR (2012) 1.Gutachter: Prof. Dr. J. Fritsche, 2. Gutachter: Dr. H. Rehbein 20. Rehbein, H.: Differentation of fish species by PCR-based DNA analysis of nuclear genes. Eur Food Res Technol 236. 2013, 979-990 21. Zur Identifizierung von indonesischen Fischen mittels Barcoding wurden bereits verschiedene Primersysteme entwickelt: Asadatun Abdullah, Hartmut Rehbein: Application of DNA Barcoding Genes as universal markers for identification of commercial fish species of Indonesian Origin, Vortrag in Brüssel, ECBOL3 Conference Sept. 2012 Asadatun Abdullah: Molekular-Identifikations-Methoden der Indonesischen Fisch und Meeres-früchten Arten, Bericht für den DAD, April 2013 Abdullah, A.; Rehbein, H.: Authentication of raw and processed tuna from Indonesian markets using DNA barcoding, nuclear gene and character-based approach. Eur Food Res Technol. 2014, DOI 10.1007/s00217-014-2266-0 Abdullah, A.; Rehbein, H. (2015): The differentiation of tuna (family: Scombridae) products through the PCR-based analysis of the cytochrome b gene and parvalbumin introns. J Sci Food Agric, DOI: 10.1002/jsfa.7111 Abdullah, A. & Rehbein, H. (2015): Authentication of closely related scombrid, catfish and tilapia species by PCR based analysis andisoelectric focusing of parvalbumin. Eur Food Res Technol, DOI 10.1007/s00217-015-2479-x 22. Erste Untersuchungsergebnisse zur Differenzierung von Seeteufeln: H. Rehbein, U. Schröder, I. Lehmann, H. Karl (2013): Neue Seeteufelarten auf dem deutschen Markt: Erste Untersuchungen zur Identifizierung und Qualität, RFL, 65, 130-133

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