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Organisation eines in silico-Ringversuchs zur Authentifizierung von Fisch und Fischprodukten mittels PCR-Sequenzierung der Genmarker cytb (§64-Methode und geplante DIN/ISO-Methode) und COI (geplante DIN/ISO-Methode)

Projekt

Ernährung und Verbraucherschutz

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Ernährung und Verbraucherschutz


Förderkennzeichen: MRI-MF-08-1050InSilicoRingversuch
Laufzeit: 01.05.2016 - 31.12.2016
Forschungszweck: Angewandte Forschung

Fischereierzeugnisse unterliegen spezifischen Kennzeichnungsverordnungen der europäischen Union (z.B. VERORDNUNG (EU) Nr. 1379/2013) und müssen zusätzlich zu der Handelsbezeichnung mit dem wissenschaftlichen Namen gekennzeichnet sein, der für jede Art eindeutig festgelegt ist. Zum Zweck des Verbraucherschutzes werden im Rahmen der deutschen Lebensmittelüberwachung in den Produktionsbetrieben und im Handel Proben von Fischereierzeugnissen gezogen, die von den Untersuchungsämtern auf die richtige Artkennzeichnung überprüft werden. Den Ämtern stehen zu diesem Zweck validierte Verfahren zur Verfügung, die laut §64 des LFGB vorgeben sind. Die derzeit am häufigsten angewandte Methode ist die Sequenzierung von PCR-Produkten eines Abschnitts aus dem Cytochrom b-Gen (cytb) (L10.00-12). Im Rahmen des EU-Projekts Labelfish wurde 2014 die Anwendung einer weiteren PCR-Sequenzierungsmethode durch einen europäischen Ringversuch getestet, bei der das universelle Barcoding-Gen Cytochrom Oxidase I (COI) analysiert wird. Durch die teilnehmenden deutschen Labore konnte eine Vergleichbarkeit beider Genmarker gezeigt werden. Eine Zertifizierung nach DIN/ISO wurde inzwischen für beide Methoden beantragt und soll 2016 verabschiedet werden. Die Ergebnisse des europäischen Ringversuchs haben jedoch auch gezeigt, dass die Bewertungen der identifizierten und mit den öffentlichen Sequenzdatenbanken GenBank und BOLD abgeglichenen DNA-Sequenzen innerhalb der Gruppe der teilnehmenden Labore zum Teil unterschiedlich ausfielen, wodurch es partiell zu abweichenden Ergebnissen bei der Identifizierung der Spezies kam. Es zeigte sich, dass hier Unklarheiten bei der Auswertung der Datenbankrecherchen zu Grunde liegen, da einheitliche Standards und Vorgaben fehlen. Die §64 LFGB-Arbeitsgruppe „Molekularbiologische Methoden zur Pflanzen- und Tierartendifferenzierung“ hat aus diesem Grund beschlossen, dass ein erneuter Ringversuch notwendig ist, der sich auf die Bewertung der Sequenzen mit Hilfe von Datenbankrecherchen konzentriert (in silico-Versuch), um die Auswertung der Sequenzierungsergebnisse zu standardisieren. Ziel des angestrebten Projekts ist die Organisation eines in-silico-Ringversuchs zur Auswertung von cytb- und COI-Gensequenzen verschiedener Fischarten zum Zweck einer standardisierten Bewertung von durch amtliche Methoden generierten Markersequenzen und damit einheitlichen Spezieszuweisung von Fischereierzeugnissen, unabhängig davon, welches Labor die Analyse durchführt. Für die Durchführung des in silico-Ringversuchs wurden insgesamt jeweils 12 DNA-Sequenzen der beiden Genmarker cytb und COI ausgewählt. Hierbei wurden v.a. Sequenzen gewählt, anhand derer die Bewältigung möglicher Schwierigkeiten bei der Bewertung des Datenbankabgleichs überprüft und bestimmte Problematiken thematisiert werden können. Zum Teil wurden Sequenzen vorliegender Proben (EU-Labelfish-Projekt) verwendet und ansonsten passende Sequenzen aus GenBank kopiert. Mit diesen Sequenzdatensätzen wurden 15 fiktive Proben definiert (entweder mit Angabe beider Genmarker oder mit nur einem Marker) und mit Handelsbezeichnungen und wissenschaftlichen Namen versehen. Des Weiteren wurde ein Anschreiben entworfen, in dem genaue Hinweise für die Durchführung der Sequenzbewertungen beschrieben waren, und ein Ergebnisformular für die Teilnehmer entworfen. Es wurden 29 Personen (hauptsächlich Mitglieder der § 64 LFGB Arbeitsgruppe „Molekularbiologische Methoden zur Pflanzen- und Tierartendifferenzierung") kontaktiert und nach Interesse an einer Teilnahme zu diesem Ringversuch befragt. Von diesen 29 Personen haben sich 20 Personen zur Durchführung bereit erklärt. Am 15. Juli wurden die Dokumente (Informationen zu den Proben mit DNA-Sequenzen, Anschreiben und Ergebnisformular) den Teilnehmern per E-Mail zugesandt und um Rücksendung der Ergebnisse bis zum 30. September gebeten. Am 31. Oktober lagen die Ergebnisse aller Teilnehmer vor. Bei der Auswertung zeigte sich, dass die verschiedenen Laboratorien bei der Bewertung der DNA-Sequenzen durch BLAST und BOLD tatsächlich in vielen Fällen zu unterschiedlichen Taxonzuweisungen gekommen waren. Dies lag z.T. daran, dass Anweisungen aus den Vorschriften nicht befolgt worden waren, in vielen Fällen waren jedoch auch Stolperfallen von BLAST und BOLD Ursache der Vielfalt der identifizierten Taxa. Die Ringversuchsergebnisse wurden den Teilnehmern zusammen mit einer detaillierten Schilderung der aufgetretenen Problematiken sowie Vorschlägen für ein weiteres Vorgehen zur Verbesserung der Analysen am 7. Dezember auf der 23. Sitzung der §64 LFGB-Arbeitsgruppe „Molekularbiologische Methoden zur Pflanzen- und Tierartendifferenzierung“ vorgestellt. Die Auswertung wurde den Teilnehmern zusätzlich am 15. Dezember per E-Mail zugesandt. Die Ergebnisse dieses Ringversuchs sind von großer Bedeutung für die Einreichung einer Methodenvorschrift bei der Internationalen Organisation für Normung (ISO). Das MRI wird, basierend auf den Versuchsergebnissen, einen vorliegenden Entwurf der angestrebten DIN-Methode überarbeiten.  

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