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Hochdurchsatz-Verfahren zur Abschätzung toxikologischer Wirkungen von Nanomaterialien
Projekt
Förderkennzeichen: BfR-ZEBET-08-1329-475
Laufzeit: 01.11.2011
- 30.07.2015
Forschungszweck: Angewandte Forschung
Für die Bewertung des toxischen Potentials neuer Nanomaterialien, die in einer Vielzahl von Variationen hergestellt werden, ist der Einsatz von in vitro Methoden unerlässlich. Um die Nanomaterialien schneller und zuverlässiger als mit herkömmlichen Methoden zu untersuchen, werden in diesem Projekt Mikroskopie-basierte Hochdurchsatz-Verfahren eingesetzt. Unter Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen werden dabei im gleichen Versuchsansatz mehrere Endpunkte (Proliferation, Zytotoxizität, Aktivierung von Stresskinasen, Transkriptionsfaktoren u.a.) gleichzeitig analysiert. Es werden Beiträge zur Aufklärung der Wirkungsmechanismen der Nanomaterialien erwartet. Mit dem mikroskopischen Hochdurchsatz-Verfahren wurde der Apoptose Assay für verschiedene Zelllinien (A549, RAW264.7, HCT116) und verschiedene Nanopartikel (NP) wie SiO2, ZnO, Ag, TiO2, Fe-oxide, CeO2 u.a. etabliert. Es können Zellzahl, Zahl der früh-apoptotischen, spät-apoptotischen und nekrotischen Zellen reproduzierbar ermittelt werden. Die Toxizität der SiO2 NP war konzentrations- und zeitabhängig und abhängig von der biomolekularen Corona. Die Ergebnisse wurden durch konventionelle Zytotoxizitätstests (LDH Freisetzung, AlamarBlue Reduktion) verifiziert. Die Anwendung von weiteren geeigneten Fluoreszenzfarbstoffen für andere Endpunkte wurde etabliert: Ca2+ Einstrom mit Fluo-4 AM, Bildung von Superoxidanionradikal mit Dihydroethidium (DHE) und Immunfluoreszenz zur Detektion des phosphorylierten H2Ax Proteins als Marker für DNA Schäden. Das Mikroskopie-basierte Hochdurchsatz-Verfahren liefert mehr Informationen in kürzerer Zeit und verbessert somit die Leistungsfähigkeit von in vitro Tests für Nanomaterialien. Zusätzlich erhöht sich die Aussagekraft, weil einzelne Zellen untersucht werden können, und die Sicherheit, weil die mikroskopische Analyse wenig anfällig für Fehlinterpretationen ist. Das Verfahren ist somit den toxikologischen in vitro Standardmethoden weit überlegen. Mechanismen von NP können zügiger analysiert werden, wodurch die Sicherheit von Nanomaterialien verbessert werden kann. Zukünftig sollte die Etablierung von weiteren immunhistochemischen Methoden im Hochdurchsatz die Aussagekraft dieses Ansatzes für die toxikologische Testung enorm verbessern, gerade im Hinblick auf Gentoxizität sowie Wirkmechanismen von Nanomaterialien.
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Toxikologie
