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Palmitoylierung des Hämagglutinins der Influenzaviren: Identifizerung von DHHC-Acyltransferasen im humanen Lungenepithel als mögliches Angriffsziel eines neuen antiviralen Medikamentes
Projekt
Förderkennzeichen: 429543273
Laufzeit: 01.01.2020
- 31.12.2022
Forschungszweck: Grundlagenforschung
Die kovalente Bindung von Fettsäuren an das Hämagglutinin (HA) der Influenzaviren ist eine für die Virusreplikation essentielle Proteinmodifikation. In unserer bisherigen Zusammenarbeit haben wir mittels Massenspektrometrie die ortsspezifische Bindung von Stearinsäure an ein Cystein am Ende der Transmembranregion und von Palmitinsäure an zwei konservierte Cysteine in der zytoplasmatischen Domäne des HA nachgewiesen. Wir (und andere) haben gezeigt, dass die Bindung von Palmitat am stärksten zur viralen Infektiosität beiträgt. In unserer jetzigen Vorarbeit haben wir mittels siRNA-Screenings in HeLa-Zellen und dem Ausschalten der gefundenen Kandidaten in HPA1 Zellen die DHHC Proteine 2, 5, 8, 15 und 20 als Acyltransferasen für das HA identifiziert. Wenn diese DHHCs mittels CRISPR/Cas9 in A549 Lungenepithelzellen einzeln ausgeschalten werden, werden sowohl die Acylierung des HAs als auch die Virustiter reduziert, was darauf hinweist, dass mehrere DHHCs synergistisch arbeiten. Wir möchten nun A549 Zellen herstellen, bei denen die Expression mehrerer DHHCs gleichzeitig inhibiert wird, bis die Acylierung des HAs und die Virusreplikation stark gehemmt sind. Wir werden analysieren, ob die identifizierten DHHC-Proteine HAs verschiedener Influenza A-Subtypen, das HA von Influenza B und das HEF von Influenza C Virus sowie Membranproteine anderer umhüllter Viren acylieren. Mittels Massenspektrometrie wird eine Reduktion der Acylierung sowie das Fettsäuremuster des HAs in Viruspartikeln bestimmt. Auf diese Weise können wir feststellen, ob ein bestimmtes DHHC-Protein nur Palmitat oder Stearat übertragen kann.Die experimentellen Daten werden durch molekulare Modellierung ergänzt. Die Kristallstruktur von DHHC 15 und 20 zeigt eine kovalent gebundene Fettsäure in einem hydrophoben Tunnel, der von den vier Transmembranregionen gebildet wird. Das schmale Ende des Tunnels wird durch zwei zwischen DHHC-Proteinen variablen Aminosäuren abgeschlossen. Die chemische Natur der zwei Aminosäuren an dieser Position bestimmt die Tiefe des Tunnels und damit die Lipidspezifität. Wir werden die hydrophoben Hohlräume anderer interessanter DHHC-Proteine modellieren, insbesondere nach einem DHHC Protein mit einem kurzen hydrophoben Tunnel suchen, der Palmitat, nicht aber Stearat aufnehmen kann. Ferner könnte die kürzlich veröffentlichte Struktur der Transmembranregion eines HA Proteins die Identifizierung der Substratbindungsstelle in den DHHC-Proteinen ermöglichen. Die computergestützten Vorhersagen werden dann durch Mutagenese der identifizierten Region und deren anschließende Analyse unter Verwendung rekombinanter Viren verifiziert.
Abschnittsübersicht
Fachgebiete
- Biotechnologie
